di VITTORIA BRAMBILLA
Attività del sistema CRISPR-Cas9. Disegno di Gaia Fornara.
L’agricoltura, per essere produttiva e sostenibile, ha la necessità di una sistematica, incessante evoluzione. Fin dalle sue origini, tra le quindici e le dieci migliaia di anni addietro, essa è sostanzialmente progredita tramite l’ottimizzazione di due strumenti: le pratiche agronomiche, sempre più efficaci, e le sementi, che portano caratteristiche di resa sempre migliori soddisfacendo le richieste dei consumatori in termini sia di quantità sia di qualità. Grazie all’ingegno dell’uomo questi due processi hanno potuto essere perfezionati durante la storia, facendo sì che l’agricoltura potesse stare al passo sia con l'entità, sia con la qualità richieste dalla popolazione umana. Così, la storia dell’uomo ha visto l’invenzione dell’aratro, l'adozione delle rotazioni, degli agrofarmaci, dei trattori, dei droni e dei GPS utili per la moderna agricoltura di precisione. Parallelamente, l’uomo ha creato le sue piante domesticando e poi migliorando le sementi perché fossero sempre più produttive e con caratteristiche aderenti ai nuovi gusti alimentari.
Il miglioramento genetico delle piante si basa sulla selezione dei caratteri che rappresentano l’espressione dell’informazione contenuta nei DNA di ciascuna pianta. Questa selezione può essere realizzata in modo inconsapevole rispetto ai mutamenti del DNA alla base del cambiamento dei caratteri, e questo è quello che è accaduto per migliaia di anni fino alla scoperta del DNA stesso e allo sviluppo delle tecniche di biologia molecolare, oppure può essere fatta consapevolmente, agendo cioè direttamente sul DNA per ottenere una pianta con un nuovo carattere favorevole.
Naturalmente, per decidere come modificare il DNA bisogna prima conoscerne il significato, ma, grazie alle nuove tecniche che permettono di sequenziare in modo rapido il DNA di interi organismi, e grazie al lavoro dei ricercatori che studiano le funzioni e le relazioni dei geni, ne abbiamo sempre maggiore cognizione.
Il metodo di miglioramento genetico più diffuso è basato sull’incrocio di due varietà con caratteristiche diverse. Questi incroci possono essere fatti senza conoscere quello che accade al DNA, rimescolando i caratteri presenti nelle due piante incrociate, dette parentali, sperando di ottenere delle piante figlie con caratteristiche migliori. Oppure gli incroci possono essere operati conoscendo le differenze nei DNA dei due parentali e il modo in cui queste andrebbero combinate per ottenere caratteristiche ottimali nelle piante derivate dall’incrocio. Per fare ciò, grazie a marcatori molecolari sul DNA stesso, il DNA può essere “seguito” dalle piante parentali alle piante figlie dell’incrocio e nelle generazioni a venire e può essere deciso a priori come si intenda combinarlo.
Grazie alle conoscenze del DNA delle piante e allo sviluppo di marcatori molecolari, possiamo quindi espandere le nostre possibilità di miglioramento genetico delle sementi, selezionando piante che portino sequenze di DNA che secondo quanto a noi noto potranno originare discendenti con caratteristiche che rispondano alle esigenze dei costitutori, a loro volta determinate da quelle dei consumatori.
Il miglioramento genetico per incroci con o senza marcatori molecolari ha originato la maggior parte delle varietà delle piante di interesse agrario oggi coltivate.
La biodiversità naturale di piante ed animali sulla Terra si è originata in molto tempo per mutagenesi spontanea nel DNA degli organismi.
La mutagenesi indotta “imita” e accelera i processi di mutagenesi spontanei e permette di espandere, sotto il controllo dell’uomo che seleziona le piante mutagenizzate, la biodiversità. Tuttavia, agendo sul DNA in modo casuale, non sempre la mutagenesi assicura risultati soddisfacenti in termini di miglioramento genetico.
Ma la ricerca scientifica non si ferma e avanza a passi veloci, le scoperte fatte per la biomedicina possono essere usate per modificare i meccanismi di base che accomunano gli organismi viventi, tra cui le piante. Nel 2012, da un’altra branca della ricerca biomolecolare, la microbiologia, arriva la sensazionale scoperta di un sistema in grado di creare nel DNA mutazioni mirate¹. Questo sistema, chiamato CRISPR e basato sulla proteina Cas9, che è in grado di riconoscere e tagliare il DNA a doppio filamento, permette ai batteri di tagliare il DNA di organismi invasori proteggendo i medesimi dai virus. Negli organismi superiori, incluse le piante, il sistema CRISPR non è presente in natura, ma può essere inserito transitoriamente per rompere il DNA e creare mutazioni in modo mirato. Tutto è possibile grazie alla peculiarità della proteina Cas9, che è in grado di legarsi ad una molecola di RNA guida che ne dirige l’appaiamento alla sequenza di DNA complementare all’RNA stesso. Scansionato il DNA e identificato il sito dove Cas9 si deve legare, questo sito può essere facilmente programmato in laboratorio disegnando a piacimento la sequenza dell’RNA guida, la Cas9 è in grado di creare una rottura nel doppio filamento di DNA. Questa rottura viene poi riparata dalla cellula che però nel fare ciò inserisce delle mutazioni². Quindi, grazie al sistema CRISPR/Cas9 è possibile creare mutazioni del tutto simili a quelle che si originano spontaneamente e a quelle che induciamo con agenti chimici e fisici mutageni. La differenza è che con CRISPR possiamo inserire la mutazione precisamente nella posizione prescelta del DNA. Oltre all’applicazione più comune di CRISPR, cioè l'inserimento di mutazioni normalmente inattivanti la funzione del tratto di DNA che le contiene, CRISPR può anche essere utilizzato per introdurre modifiche mirate nel DNA. Questo può essere realizzato o tramite l’induzione della ricombinazione omologa nel DNA oppure tramite la sostituzione di singole lettere del DNA grazie alla versione di CRISPR chiamata base editing, di cui parleremo in seguito. Se due rotture nel DNA vengono indotte a breve distanza e contemporaneamente alla rottura si fornisce del DNA stampo per riparare la rottura, talvolta la cellula sceglie di riparare il DNA danneggiato usando il DNA stampo. Questo permette quindi di sostituire una sequenza di DNA, espandendo le potenzialità dei cambiamenti nel DNA ottenibili tramite CRISPR. Questa applicazione rimane comunque trascurabile rispetto alle applicazioni di CRISPR nel miglioramento genetico in agricoltura perché presenta ancora delle difficoltà tecniche e una bassa efficienza³, su cui però i ricercatori stanno lavorando⁴.
Ma la scienza non si ferma e da un paio d’anni al sistema CRISPR è stato accoppiato un altro sistema che permette di modificare ad hoc le singole lettere del DNA invece che creare mutazioni in una sequenza di DNA mirate ma casuali⁵-⁷. Questa variante di CRISPR sfrutta una versione modificata della proteina Cas9 che può riconoscere il DNA bersaglio grazie all’RNA guida programmabile, ma non tagliarlo. Al contrario, le quattro lettere (o nucleotidi) del DNA possono essere convertite singolarmente da una in un’altra.
Esistono dunque oggi tre principali strumenti per fare miglioramento genetico basato su CRISPR: CRISPR e riparazione casuale, CRISPR con riparazione da DNA stampo e CRISPR base editing. Tra questi la scelta può essere decisa in base alle tipologie di cambiamento del DNA utili al miglioramento genetico che si intende ottenere.
CRISPR e le sue evoluzioni sono dunque arrivate in un momento in cui siamo in grado di decodificare con sempre maggiore precisione i DNA delle piante e sappiamo dove dovremmo introdurre un mutamento nel DNA per ottenere una pianta geneticamente migliorata⁸. Grazie a CRISPR possiamo inserire modifiche nel DNA dirette secondo le conoscenze ottenute dal lavoro dei ricercatori che si occupano di ricerca di base.
Che CRISPR sia o non sia aggiunto alla cassetta degli attrezzi dei breeder non è, però, più una scelta scientifica ma politica. La comunità scientifica internazionale si è espressa unanimemente sulla bontà, la sicurezza e l’utilità di questa tecnica, ma la politica europea, sull’onda dell’atteggiamento di divieto in auge per altre tecnologie di miglioramento genetico basate su tecniche di biologia molecolare quali gli OGM, mantiene una posizione restrittiva anche su CRISPR.
Mentre, dunque, sia paesi storicamente favorevoli agli OGM, quali Stati Uniti e Argentina, che paesi storicamente restrittivi verso gli OGM come il Giappone, hanno già approvato l’utilizzo di CRISPR per il miglioramento genetico in agricoltura, l’Europa ne ha bloccato l’utilizzo.
Infatti, una sentenza della Corte di Giustizia Europea del 25 luglio 2018 ha sancito che gli organismi CRISPR ricadono nella definizione di OGM espressa dalla Direttiva 2001/18 EC e devono pertanto per ora essere regolamentati come tali. Assimilare però CRISPR agli OGM è come vietarne l'impiego, perché in Europa (a parte l'eccezione del mais BT coltivato in Spagna e Portogallo) non si coltivano OGM ma si consumano solo quelli prodotti altrove. Scienziati, coltivatori e aziende sementiere chiedono all’Europa di rivedere le proprie posizioni politiche tramite petizioni firmate da numerosi istituti e cittadini. Perché anche questa volta l’Europa non faccia la scelta di restare ferma imponendosi un ruolo di crescente gravità, per la propria sicurezza alimentare, accrescendo l’importazione di prodotti agricoli dagli altri continenti.
Il miglioramento genetico delle piante si basa sulla selezione dei caratteri che rappresentano l’espressione dell’informazione contenuta nei DNA di ciascuna pianta. Questa selezione può essere realizzata in modo inconsapevole rispetto ai mutamenti del DNA alla base del cambiamento dei caratteri, e questo è quello che è accaduto per migliaia di anni fino alla scoperta del DNA stesso e allo sviluppo delle tecniche di biologia molecolare, oppure può essere fatta consapevolmente, agendo cioè direttamente sul DNA per ottenere una pianta con un nuovo carattere favorevole.
Naturalmente, per decidere come modificare il DNA bisogna prima conoscerne il significato, ma, grazie alle nuove tecniche che permettono di sequenziare in modo rapido il DNA di interi organismi, e grazie al lavoro dei ricercatori che studiano le funzioni e le relazioni dei geni, ne abbiamo sempre maggiore cognizione.
Il metodo di miglioramento genetico più diffuso è basato sull’incrocio di due varietà con caratteristiche diverse. Questi incroci possono essere fatti senza conoscere quello che accade al DNA, rimescolando i caratteri presenti nelle due piante incrociate, dette parentali, sperando di ottenere delle piante figlie con caratteristiche migliori. Oppure gli incroci possono essere operati conoscendo le differenze nei DNA dei due parentali e il modo in cui queste andrebbero combinate per ottenere caratteristiche ottimali nelle piante derivate dall’incrocio. Per fare ciò, grazie a marcatori molecolari sul DNA stesso, il DNA può essere “seguito” dalle piante parentali alle piante figlie dell’incrocio e nelle generazioni a venire e può essere deciso a priori come si intenda combinarlo.
Grazie alle conoscenze del DNA delle piante e allo sviluppo di marcatori molecolari, possiamo quindi espandere le nostre possibilità di miglioramento genetico delle sementi, selezionando piante che portino sequenze di DNA che secondo quanto a noi noto potranno originare discendenti con caratteristiche che rispondano alle esigenze dei costitutori, a loro volta determinate da quelle dei consumatori.
Il miglioramento genetico per incroci con o senza marcatori molecolari ha originato la maggior parte delle varietà delle piante di interesse agrario oggi coltivate.
- Gli incroci sono dunque strumenti oltremodo efficienti, ma presentano due limiti: il tempo: occorrono molte generazioni (e dunque molti anni, anche decenni, in base alla specie) per “fissare” i caratteri desiderati;
- le varianti nel DNA devono essere presenti in piante parentali interfertili. Non si può, in generale, “creare” un carattere se non è in qualche modo presente in varietà della specie che si intende migliorare (o in specie interfertili – ma questo complica un po’ le cose a ragione delle eccessive differenze nel DNA di specie diverse), così come non si possono inserire caratteri da specie diverse se non sono incrociabili, e non si possono combinare i loro DNA. Il lavoro del genetista “classico” si limita dunque a rimescolare i caratteri a partire dalla variabilità genetica presente (che può anche definirsi biodiversità) all’interno dei genomi di piante interfertili.
La biodiversità naturale di piante ed animali sulla Terra si è originata in molto tempo per mutagenesi spontanea nel DNA degli organismi.
La mutagenesi indotta “imita” e accelera i processi di mutagenesi spontanei e permette di espandere, sotto il controllo dell’uomo che seleziona le piante mutagenizzate, la biodiversità. Tuttavia, agendo sul DNA in modo casuale, non sempre la mutagenesi assicura risultati soddisfacenti in termini di miglioramento genetico.
Ma la ricerca scientifica non si ferma e avanza a passi veloci, le scoperte fatte per la biomedicina possono essere usate per modificare i meccanismi di base che accomunano gli organismi viventi, tra cui le piante. Nel 2012, da un’altra branca della ricerca biomolecolare, la microbiologia, arriva la sensazionale scoperta di un sistema in grado di creare nel DNA mutazioni mirate¹. Questo sistema, chiamato CRISPR e basato sulla proteina Cas9, che è in grado di riconoscere e tagliare il DNA a doppio filamento, permette ai batteri di tagliare il DNA di organismi invasori proteggendo i medesimi dai virus. Negli organismi superiori, incluse le piante, il sistema CRISPR non è presente in natura, ma può essere inserito transitoriamente per rompere il DNA e creare mutazioni in modo mirato. Tutto è possibile grazie alla peculiarità della proteina Cas9, che è in grado di legarsi ad una molecola di RNA guida che ne dirige l’appaiamento alla sequenza di DNA complementare all’RNA stesso. Scansionato il DNA e identificato il sito dove Cas9 si deve legare, questo sito può essere facilmente programmato in laboratorio disegnando a piacimento la sequenza dell’RNA guida, la Cas9 è in grado di creare una rottura nel doppio filamento di DNA. Questa rottura viene poi riparata dalla cellula che però nel fare ciò inserisce delle mutazioni². Quindi, grazie al sistema CRISPR/Cas9 è possibile creare mutazioni del tutto simili a quelle che si originano spontaneamente e a quelle che induciamo con agenti chimici e fisici mutageni. La differenza è che con CRISPR possiamo inserire la mutazione precisamente nella posizione prescelta del DNA. Oltre all’applicazione più comune di CRISPR, cioè l'inserimento di mutazioni normalmente inattivanti la funzione del tratto di DNA che le contiene, CRISPR può anche essere utilizzato per introdurre modifiche mirate nel DNA. Questo può essere realizzato o tramite l’induzione della ricombinazione omologa nel DNA oppure tramite la sostituzione di singole lettere del DNA grazie alla versione di CRISPR chiamata base editing, di cui parleremo in seguito. Se due rotture nel DNA vengono indotte a breve distanza e contemporaneamente alla rottura si fornisce del DNA stampo per riparare la rottura, talvolta la cellula sceglie di riparare il DNA danneggiato usando il DNA stampo. Questo permette quindi di sostituire una sequenza di DNA, espandendo le potenzialità dei cambiamenti nel DNA ottenibili tramite CRISPR. Questa applicazione rimane comunque trascurabile rispetto alle applicazioni di CRISPR nel miglioramento genetico in agricoltura perché presenta ancora delle difficoltà tecniche e una bassa efficienza³, su cui però i ricercatori stanno lavorando⁴.
Ma la scienza non si ferma e da un paio d’anni al sistema CRISPR è stato accoppiato un altro sistema che permette di modificare ad hoc le singole lettere del DNA invece che creare mutazioni in una sequenza di DNA mirate ma casuali⁵-⁷. Questa variante di CRISPR sfrutta una versione modificata della proteina Cas9 che può riconoscere il DNA bersaglio grazie all’RNA guida programmabile, ma non tagliarlo. Al contrario, le quattro lettere (o nucleotidi) del DNA possono essere convertite singolarmente da una in un’altra.
Esistono dunque oggi tre principali strumenti per fare miglioramento genetico basato su CRISPR: CRISPR e riparazione casuale, CRISPR con riparazione da DNA stampo e CRISPR base editing. Tra questi la scelta può essere decisa in base alle tipologie di cambiamento del DNA utili al miglioramento genetico che si intende ottenere.
CRISPR e le sue evoluzioni sono dunque arrivate in un momento in cui siamo in grado di decodificare con sempre maggiore precisione i DNA delle piante e sappiamo dove dovremmo introdurre un mutamento nel DNA per ottenere una pianta geneticamente migliorata⁸. Grazie a CRISPR possiamo inserire modifiche nel DNA dirette secondo le conoscenze ottenute dal lavoro dei ricercatori che si occupano di ricerca di base.
Che CRISPR sia o non sia aggiunto alla cassetta degli attrezzi dei breeder non è, però, più una scelta scientifica ma politica. La comunità scientifica internazionale si è espressa unanimemente sulla bontà, la sicurezza e l’utilità di questa tecnica, ma la politica europea, sull’onda dell’atteggiamento di divieto in auge per altre tecnologie di miglioramento genetico basate su tecniche di biologia molecolare quali gli OGM, mantiene una posizione restrittiva anche su CRISPR.
Mentre, dunque, sia paesi storicamente favorevoli agli OGM, quali Stati Uniti e Argentina, che paesi storicamente restrittivi verso gli OGM come il Giappone, hanno già approvato l’utilizzo di CRISPR per il miglioramento genetico in agricoltura, l’Europa ne ha bloccato l’utilizzo.
Infatti, una sentenza della Corte di Giustizia Europea del 25 luglio 2018 ha sancito che gli organismi CRISPR ricadono nella definizione di OGM espressa dalla Direttiva 2001/18 EC e devono pertanto per ora essere regolamentati come tali. Assimilare però CRISPR agli OGM è come vietarne l'impiego, perché in Europa (a parte l'eccezione del mais BT coltivato in Spagna e Portogallo) non si coltivano OGM ma si consumano solo quelli prodotti altrove. Scienziati, coltivatori e aziende sementiere chiedono all’Europa di rivedere le proprie posizioni politiche tramite petizioni firmate da numerosi istituti e cittadini. Perché anche questa volta l’Europa non faccia la scelta di restare ferma imponendosi un ruolo di crescente gravità, per la propria sicurezza alimentare, accrescendo l’importazione di prodotti agricoli dagli altri continenti.
Bibliografia.
1. Jinek, M. et al. A Programmable Dual-RNA – Guided DNA Endonuclease in Adaptice Bacterial Immunity. Science 337, 816–822 (2012).
2. Borrelli, V. M. G., Brambilla, V., Rogowsky, P., Marocco, A. & Lanubile, A. The Enhancement of Plant Disease Resistance Using CRISPR/Cas9 Technology. Front. Plant Sci. (2018). doi:10.3389/fpls.2018.01245
3. Wang, M. et al. Gene Targeting by Homology-Directed Repair in Rice Using a Geminivirus-Based CRISPR/Cas9 System. Molecular Plant (2017). doi:10.1016/j.molp.2017.03.002
4. Li, S. et al. Precise gene replacement in rice by RNA transcript-templated homologous recombination. Nature Biotechnology (2019). doi:10.1038/s41587-019-0065-7
5. Li, C. et al. Expanded base editing in rice and wheat using a Cas9-adenosine deaminase fusion. Genome Biol. (2018). doi:10.1186/s13059-018-1443-z
6. Zong, Y. et al. Precise base editing in rice, wheat and maize with a Cas9-cytidine deaminase fusion. Nat. Biotechnol. (2017). doi:10.1038/nbt.3811
7. Shimatani, Z. et al. Targeted base editing in rice and tomato using a CRISPR-Cas9 cytidine deaminase fusion. Nat. Publ. Gr. 35, 441–443 (2017).
8. Gao, C. The future of CRISPR technologies in agriculture. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. (2018). doi:10.1038/nrm.2018.2
E’ ricercatrice dal 2017 in Botanica Generale presso il Dipartimento di Scienze Agrarie e Ambientali dell’Università Statale di Milano. Si occupa di miglioramento genetico di riso. Dopo avere conseguito il dottorato di ricerca in Biologia Vegetale presso la Statale di Milano, dal 2008 al 2011 è stata ricercatrice post-doc al Max Planck Institute for Plant Breeding Research di Colonia e successivamente al Dipartimento di Bioscienze e di Scienze Agrarie e Ambientali della Statale di Milano.
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